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          1. 自然界中阿卡波糖的完整生物合成途徑

            時間:2022-08-19  作者:泰和醫藥

            作為一種重要的治療2型糖尿病藥物α-糖苷酶抑制劑,阿卡波糖(Acarbose)由拜耳公司開發,自1996年以來一直在市場上銷售(商品名為“拜唐蘋”),主要通過抑制人類分解復雜碳水化合物的α-糖苷酶來幫助控制機體的血糖水平。這種獨特的機制非常適用于以碳水化合物(如面食)為主食的中國人群,因此阿卡波糖在中國的2型糖尿病的銷售額是很可觀的。在國家的第二次集采中,拜耳公司報價是5.42規格50 mg/30),折算單片價格為0.1807元,比規定的最高有效申報價(0.8353元/片)還低了近80%。這也極大方便了高血糖和糖尿病人群。


            阿卡波糖來自土壤中的細菌,但直到現在它的生物合成途徑還不為人所知。根據國際糖尿病聯合會的統計,2型糖尿病影響著全球近5億成年人。


            阿卡波糖來自游動放線菌(Actinoplanes)和幾種其他的土壤細菌菌株。阿卡波糖是放線菌株的產物,不同于普通的化學藥品,阿卡波糖是由生物工程發酵合成。正因如此在生產過程中對原料及工藝的要求較高。盡管生物合成的工藝已經非常成熟,生產的阿卡波糖可滿足日益增加的高血糖和糖尿病人群的需要,但直到現在阿卡波糖的生物合成途徑還不為人所知,它在自然界的合成過程還沒有系統清楚的研究。


            2022615日,著名期刊Nature旗下的《Nature Communications》(2022年最近的影響因子17.694)上線了一篇名為“Complete biosynthetic pathway to the antidiabetic drug acarbose”,全面揭示了阿卡波糖在自然界中的完整生物合成途徑。通訊作者是來自美國俄勒岡州立大學的Taifo Mahmud。篇文章為通過生物技術改進阿卡波糖的生產提供了重要的支持。


            研究人員認為阿卡波糖(Acarbose,1)的化學結構由假糖(C7-環醇)和麥芽糖組成,假糖通過C-N鍵連接到氨基脫氧己糖上。目前已有研究提出并驗證了阿卡波糖中C7-環醇的生物合成過程(即1b中紫色箭頭部分)。阿卡波糖的C7-環醇單元源自2-epi-5-epi–valioloneEEV,4),經由紫色箭頭路徑中多步酶催化反應,最終生成valienol 7-phosphateV7P,12,但V7P12)之后的下游合成過程仍未可知。之前也有報道,有研究團隊基于Actinoplanes sp. SE50/110的阿卡波糖生物合成基因簇的分析,進一步推測了阿卡波糖的生物合成過程(1b中藍色箭頭),但沒有生化證據支持該推測。因此,Taifo Mahmud研究團隊對阿卡波糖的最后的生物合成過程展開了詳細的研究,闡明了阿卡波糖生物合成的未知步驟,并提出了完整的生物合成途徑。



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             圖1. 放線菌Actinoplanes sp. SE50/110中的阿卡波糖生物合成過程圖。a:Actinoplanes sp.SE50/110中的阿卡波糖生物合成基因簇。b:阿卡波糖生物合成途徑。紫色粗箭頭表示在本研究之前已明確的生化步驟(藍色背景色)。藍色和紅色箭頭表示先前提出的合成路徑。黑色粗箭頭顯示了本研究中闡明的合成途徑(黃色背景色)。圖片來源:https://doi.org/10.1038/s41467-022-31232-4。


            有研究表明化合物valienol 7-phosphateV7P,12是阿卡波糖生物合成的中間體之一。Mahmud團隊猜測化合物V7P12會被磷酸化為V1,7PP13或經磷酸葡萄糖變位酶的作用直接轉化為valienol 1-phosphateV1P,15。最終,確定了表明AcbU有效地將V7P12轉化為V1,7PP13)的,V7P12AcbU產生V1,7PP13的首選底物,V1P15)不是AcbU的底物,不過Mahmud團隊發現另一種酶AcbJ有效催化化合物V7P12V1,7PP13去磷酸化。穩態動力學研究表明,AcbJ通過將V1,7PP13去磷酸化為V1P15)參與了阿卡波糖生物合成途徑,并且AcbJ選擇性地使C-7磷酸基團去磷酸化,而不使C-1磷酸基團去磷酸化。


            接下來,Mahmud團隊Streptomyces lividans TK24中表達假定的核苷酸轉移酶AcbR。體外酶反應證實AcbR能夠有效地將V1P15)轉換為nucleoside diphosphate-valienolNDP-V,16,且GTP是最優的底物,UTP次之。因此V1P15)是最可能的AcbR底物,并且C-7的去磷酸化先于C-1的核苷酸化。


            隨后,Mahmud團隊驗證了兩個推定的糖基轉移酶AcbIAcbS的功能。他們AcbIdTDP-4-amino-4,6-dideoxyglucose19和麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖或麥芽五糖一起孵育。LC-MS結果表明AcbI能夠催化19和麥芽糖之間的偶聯產生4-aminoDGG17。在通過重組AcbS孵育確實產生了阿卡波糖(Acarbose,1)。AcbS是催化形成非糖苷CN鍵的途徑中唯一的假糖基轉移酶(PsGT)。最終,Mahmud團隊重構了從V1P15)合成阿卡波糖(Acarbose,1)的途徑,成功得到了阿卡波糖。如1b所示(黃色背景色)。


            總結:Mahmud團隊通過生物信息學分析和體外酶反應,證實了阿卡波糖的完整生物合成途徑:假糖(C7-環醇)片段和麥芽糖片段最終在假糖基轉移酶AcbS的催化作用下通過非糖苷C-N鍵連接形成阿卡波糖。不僅揭示了這種高價值藥物是如何在自然界中制造的,而且還為進一步改進阿卡波糖的工業生產奠定了基礎。


            參考資料:Takeshi Tsunoda, Arash Samadi, Sachin Burade, Taifo Mahmud. Complete biosynthetic pathway to the antidiabetic drug acarbose. Nature Communications., 2022, 13, 3455. doi: 10.1038/s41467-022-31232-4. 鏈接網址:https://doi.org/10.1038/s41467-022-31232-4


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